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小份子、大份子药物生物阐发及表征手艺进展

发布时间:2017/11/30 00:00

  布局确认、生物阐发、表征和质量节制方式等的研究是药物研发进程中的主要环节,这些研究必需尽量精确、活络且具有选择性。在曩昔30年里,液相色谱和串连质谱(LC-MS-MS)手艺一向是很多小份子药物阐发的首选方式。在此时代,阐发手艺的高速成长为活络莱宝氦质谱检漏仪、靠得住方式的开辟供给了撑持。可是当前制药/生物制药行业依然渴求更壮大的东西和更多样的方式,特别是在市场上呈现愈来愈多的大份子医治药物的环境下。本文会商了今朝小份子及大份子药物生物阐发进程中的题目,和阐发方式开辟中的新趋向等。

  液相色谱-质谱联用手艺从上世纪90年月起即普遍利用于药物发现和研发尝试室,由于这类手艺有能力在含有成百上千种其他物资的样品中快速辨认和量化低浓度化合物。LC-MS-MS手艺在小份子药物的布局阐发、ADME及生物阐发研究中尤其主要。在化合物浓度不竭下降的环境下,这项利用的难度在于对方式切确性和重现性的高尺度要求。最近几年来,生物药物的成长很是敏捷,这些大份子药物的阐发也面对着一系列挑战,同时也鞭策了手艺和方式的新进展。

  小份子药物生物阐发

  几十年来,药物开辟职员一向在样本搜集进程中利用生物阐发手段来测定给定样本中药物的精确浓度。这些研究的精确性取决于阐发方式和尝试室阐发仪器的靠得住性,所利用的方式及仪器应可以或许选择性、特异性地量化方针化合物。因为生物阐发样本(如血浆、血液和其他复杂的基质)中常常含有高含量布局相干或非相干化合物,这一阐发一向出格具有挑战性。这些因可能会致使亲缘试剂或其他不相干化合物共洗脱的交叉反映会影响尝试的精确性和重现性。

  多年来,为了应对这些挑战,人们开辟了良多基于LC-MS-MS的方式,改良了药物定量尝试的活络度、通量、精确性和重现性。一种经常使用的方式是在三重四级杆质谱系统中利用多重反映监测(MRM)手艺来下降噪声,同时进步量化的选择性与精确性。比来这类方式已扩大至MRM3手艺,经由过程增添碎片化步调而改良选择性。现在,三重四级杆质谱系统已被用于开辟浓度低至pg/ mL的小份子药物的检测方式,且具有杰出的重现性、线性规模和信噪比。

  因为基质干扰,某些化合物在生物样品中出格难以分手,这可能会致使呈现未分辩的峰或基线噪音太高,从而影响数据重现性、精确性和动态规模。凡是,这这类题目可所以经由过程额外的样本处置进程或利用速度较慢的色谱来解决。但是,因为样品通量所带来的压力,如许的解决体例会为大大都药物开辟尝试室增添额外的时候、金钱和劳动力本钱。曩昔的几年内,呈现了有用的替换手艺,行将离子迁徙谱与LC-MS手艺相连系,从而进步选择性。它可以以离子迁徙装配的情势毗连到TOF或三重四级杆质谱的前端,或也能够直接内置在TOF质谱系统内,但这类方式大都没法知足生物阐发尝试中速度、选择性和耐用性之间的均衡。比来,在阐发的LC和MS阶段之间,已开辟出了多种分歧的离子迁徙分手装配。这些使离子按照迁徙轨迹的分歧而分隔,而不是按照时候而分手,如许就往除布景化合物的影响,从而供给了一个花费更短MRM周期时候的系统,以便快速精确地检测复杂基质中的低浓度化合物。

  今朝,愈来愈多生物阐发尝试室采取基于微流LC的方式来阐发低浓度程度的化合物。这项手艺利用更小的色谱柱(直径小于1mm)和电极,以取得更快速、更活络和更高分辩率的成果,同时将柱后分离降到最低。较低的流速也进步了电离效力、削减了离子按捺,同时大大下降了样品及溶剂的利用量,为制药开辟进程带来了经济和环保方面的上风。微流LC所需要的样品体积较低,这也刚好合适制药行业在采取显微取样手艺进行毒物学和生物阐发研究等方面的需求。另外,微流LC还可以连系分歧离子迁徙质谱,从而活络地对生物样品中的化合物进行选择性阐发。

  大份子药物生物阐发

  生物阐发方式的精确性、耐用性和重现性依然是药物研发职员和监管部分所存眷的关头题目。但是,传统的用于小份子药物生物阐发的LC-MS方式凡是其实不合用于研究大份子药物,如抗体、发展因子、寡核苷酸和重组肽等。这些份子具有更大的尺寸和复杂性,这就意味着在阐发它们之前凡是需要大量的样品制备进程,且它们的吸附特征和布景卵白的干扰会进一步影响定量的精确性。

  LC-MS-MS方式颠末优化后可直接阐发10kDa以下的小肽;而在定量阐发之前,凡是需要利用免疫反映介导的样本提取和/或样品富集步调来加强选择性。而对更大的卵白质,凡是需要更复杂的工作流程,包罗在利用LC-MS方式对代表性肽进行阐发之前的卵白质水解。这类间接阐发的方式被尝试职员普遍采取,但却很是复杂,并会遭到诸如可变肽开释等的影响。另外,监管部分也还还没有对这些方式的验证方式发布指点原则。

  如ELISA等的配体连系阐发(LBAs)方式是一种成熟的卵白质定量手艺,且对生物阐发来讲,它们的上风还在于其有能力同时检测人体轮回中的游离药物和药物的活性布局。但是,LBAs方式也有很多局限性,影响了它们在高通量药物开辟中的利用。在比来的一项研究中,研究职员已起头将LBAs方式与LC-MS方式连系起来。这些方式上的进展得益于三重四级杆及QTRAP质谱系统等手艺的改良,包罗活络度的进步,便可在低至毫克至微克的程度上检测大份子。这些新手艺改良了电离与采样效力,增添了动态规模和可切换质量规模,并且许可分歧质量的离子经由过程探测器。是以才开辟除良多颠末验证的方式用以测定各类具有阐发难度的药物,如细胞因子按捺剂、阿达木单抗、升糖激素、胰高血糖素、胰岛素近似物、胰岛素和如用于本身免疫性疾病的英夫利昔和用于乳腺癌的曲妥珠单抗等的抗体医治药物。

  大份子表征

  大都大份子药物在出产进程中轻易产生序列改变和生物转化纷歧致的现象。这些改变对药物的有用性、生物操纵度和平安性城市造成影响。是以,药物阐发尝试室会按期进行卵白质的表征研究,以监测序列降解和转录后润色,如氨基酸的改变和糖基化。这些研究凡是采取LBAs或毛细管电泳(CE)手艺。CE手艺是一种壮大的、耐用的方式,但在完全的表征进程中却很是花费人力和时候,出格是在处置复杂药物如抗体药物偶联物(ADC)时,其表征可能需要分歧阐发方式的频频运行和复杂的数据处置进程。

  最近几年来,手艺的进展激发了几种卵白质表征方式的改良。别的,CE手艺与电喷雾离子化手艺(CESI)的整合也促使了CESI-MS手艺的成长,大大加快与简化了卵白质阐发。将CE手艺的高分手效力与纳流LC连系,能最大限度地进步电离效力,并削减离子按捺。CESI-MS系统采取开管毛细管,最大限度地削减了死体积,从而进步了活络度和峰值效力。同时因为没有固定相,也避免了肽的丢掉或过度保存。在比来的一个案例中,在利用单一卵白酶消化后利用CESI–MS方式的单次运行以后,抗乳腺癌药物曲妥珠单抗被完全表征。该方式包括了100%的序列,并且辨别了几个关头的氨基酸润色;在统一分手中还完成了完全的糖肽阐发。

  生物转化如脱酰胺、氧化和布局的改变是LBAs等的传统方式所面对的挑战。曲妥珠单抗布局中的一个关头位置在体内会产生脱酰胺感化,而在颠末验证的ELISA方式中并没有法辨认这类脱酰胺现象。人们比来开了一种LC-MS-MS方式来定量监测这类生物转化感化,采取胰卵白酶消化的方式,利用选择反映监测(SRM)对特点肽进行定等离子体质谱仪量。尝试成果表白,该方式能同时有用地定量阐发脱酰胺旌旗灯号敏感肽及其脱酰胺产品。

  结论

  成功的药物开辟及药物平安性研究依靠于大份子药物在研发或表征进程中某些步调,及一系列相干阐发测试进程。这些阐发方式的精确性和重现性对产业界和患者来讲长短常主要的。多年来,因为剧烈的竞争情势和制药行业严酷的监管特征,我们看到了阐发手艺的延续成长。特别是最近几年来仪器自己及方式开辟上的一系列进展,帮忙人们开辟了良多全新的医治药物及加倍复杂的化合物。在将来,这些在线检漏仪研究还将需要更多快速的、选择性强的和精准的阐发方式。

  注:本文为仪器信息网翻译,原题目为“Trends and Challenges for Bioanalysis and Characterization of Small and Large Molecule Drugs”,作者为SCIEX全球制药/生物制药高级市场司理Suma Ramagiri博士。


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