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“鸟枪法(shotgun)”定量卵白质组学手艺先容

发布时间:2017/11/30 00:00

  简介:

  1999年,Yates研究组提出“鸟枪法”(shotgun),其根基手艺线路是针对液体或SDS-PAGE条带的复杂夹杂物用酶(Trypsin)酶解成肽段夹杂物,然后对肽夹杂物进行多维毛细管液相色谱分手和串连质谱阐发和数据库检索,从而肯定卵白质的种类,可同时判定成百上千种卵白质。他们把这类思绪称为多维卵白质判定手艺,即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。与传统的双向电泳手艺比拟具有活络度更高,动态检测规模更广等特点。

  鸟枪法(shotgun)可以阐发全细胞裂解样品和组织抽提物,也能够阐发亚细胞分级组分、分手的细胞器等其他亚卵白质组。若是样品已过不变同位素标识表记标帜。按照分歧标识表记标帜的旌旗灯号强度比例便可以切确肯定化学上具有均一性的卵白在分歧样品中的相对品貌,这类多重阐发可以操纵在谱图上发生前后顺序的质量标识表记标帜得以完成。质谱阐发之前在样品中插手同位素标识表记标帜的某种质量校准肽,经由过程对此肽的相对定量便可以取得尽对定量的信息。实现目标肽段的尽对定量,而这一性质可以被充实利用以供给临床诊断的尺度值或阈值。

  差别卵白质的定量研究是基于肽段程度而非完飞行时间质谱仪全的卵白质,成为该手艺最大的手艺特点,该手艺实现了样品分手与判定直接结合,完全主动化操纵,可以用于各类卵白质夹杂物的卵白质组学阐发,如血清、组织、各类体液和尿液等。

  手艺线路:

  鸟枪法为基因组测序,是先将基因组打断,分段测序, 然后操纵计较机重组在一路。从而肯定一段的基因序列。

  鸟枪法在卵白质组研究中的利用体例与此相近似,起首将卵白质夹杂物酶解成肽段的夹杂物, 操纵质谱进行阐发肯定该肽段的氨基酸序列,然后计较机按照设定好的运算法例按照肽段的信息在理论卵白质数据库中检索出这些卵白质,从而肯定该夹杂物中的卵白质成份。

  阐发方针四级杆质谱仪

  寻觅差别表达卵白,并阐发卵白功能。

  Gene ontology阐发

  GO数据库包括了基因介入的生物进程,所处的细胞位置,阐扬的份子功能三方面功能信息,并将概念粗细分歧的功能概念组织成DAG(有向无环图)的布局。Gene Ontology是一个利用有节制的辞汇表和严酷界说的概念关系,以有向无环图的情势同一暗示各物种的基因功能分类系统,从而较周全地归纳综合了基因的功能信息,改正了传统功能分类系统中常见的维度混合题目。在基因表达谱阐发中,GO经常使用于供给基因功能分类标签和基因功能研究的布景常识。操纵GO的常识系统和布局特点,旨在挖掘与基因差别表达现象联系关系的单个特点基因功能类或多个特点功能类的组合。

  对每种表达趋向的基因,选择性的进gene ontology功能阐发。对差别表达的所有基因向gene ontology数据库的各节点映照。计较每一个节点的基因数量,并连系全部数据库的基因作为布景分部,对每一个节点,获得一个2x2的表格,利用超几何散布查验基因在每一个GO节点的富集或窘蹙水平。

  Pathway enrichment阐发

  找出差别表达基因在生物学通路中的位置,以说明其生物学功能和分歧基因之间的彼此感化。

  1)把差别表达基因定位在生物学通路(Pathway)上。

  2)统计阐发,肯定差别基因能否可以代表某些生物学通路

  长处:信息量大,样本量低,检测低品貌卵白更多,相对定量

  利用范畴:

  1)差别卵白组阐发(疾病初期诊断、疗效监测)

  2)细胞差别性阐发(如公理转染vs空载、方针基因RNAi vs空载)

  3)疾病标记检测(肿瘤标记物,如无血清培育后的排泄卵白质组)

  4)医治检测(术前vs术后)

  5)药物开辟(给药vs对比)

  6)癌症研究(原位肿瘤细胞系vs转移)

  Shotgun法可以检测动态规模10000:1内的低品貌肽段,是今朝卵白质组学研究最首要的手艺线路。 现已成功利用于中大范围卵白质的分手判定,不再依靠于双向凝胶电泳。

  因大部门卵白质在酶解后总有部门肽段是可用质谱判定的,是以,多维卵白质判定手艺填补了碱性、疏水卵白质、相对份子量极大和极小卵白质在分手和判定方式上的不足。

  该方式可到达对低品貌卵白、极端等电点、份子量、完全膜卵白具有与其他卵白有不异的活络度。 如鸟枪法可判定出10个跨膜域以上的膜卵白,而2DE仅能检测出2~4个跨膜域的。

  Shotgun法可实现主动化、快速、高通量的卵白组学阐发。

  但Shotgun法数据冗余复杂,需要专业职员进行阐发。

  在医学范畴,Shotgun手艺可用于以下方面:

  除血清血浆外,还可用于研究体液及组织的卵白组

  排泄卵白组

  大脑皮层神经元细胞卵白组

  新生物标识表记标帜物的发现

  疫苗研究,阐发传染源的概况卵白质,从而发现潜伏的抗原。如,在阐发人类疟疾致病源plasmodium falciparum时,发现了大量潜伏的抗原, 今朝这些抗原的特征巳经被评估出来。

  发现新的药靶。如,研究发现甲硫氨酸氨基肤酶是肿瘤发展按捺因子bengmide的份子感化靶点。

  部门参考文献:

  1)A proteomics approach to discovering natural products and their biosynthetic pathways, Stefanie B Bumpus, Bradley S Evans, Paul M Thomas, Ioanna Ntai1, Neil L Kelleher, Nature Biotechnology,27,951-956,2009

  2)High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes, Paola Picotti, Oliver Rinner, Robert Stallmach, Franziska Dautel, Terry Farrah, Bruno Domon, Holger Wenschuh, Ruedi Aebersol无机质谱d, Nature Methods 7, 43-46 (6 December 2009)

  3)Large-scale analysis of the yeast proteome by means of multidimensional protein identification technology, MP Washburn, D Wolters and J R YatesNature Biotechnology, 19, 242-247, 2001

  4)Comparison of alternativeanalyticaltechniques for the characterisationof thehuman serumproteomein HUPO Plasma ProteomeProject, XiaohaiLi, Xiaohong Qian etc Proteomics, 5, 3423–3441,2005

  5)An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics, Dirk A Wolters, Michael P Washburn, and John R Yates, Anal Chem, 73 (23), 5683-5690, 2001

 

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